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超低温冷冻影响卵母细胞CD9的表达

卵母细胞的超低温冷冻保存过程中温度的剧烈波动对卵母细胞DNA和细胞骨架造成损伤,如冷冻保护剂的渗入导致细胞结构的损伤,主要影响微丝微管、染色体、细胞膜等结构,进而引起一定程度的细胞分子水平上的损伤,包括DNA、RNA损伤及重要蛋白的损伤。冷冻解冻过程中虽然避免了细胞内冰晶的形成,但是温度的变化会使细胞外液形成冰晶,而卵母细胞冷冻解冻过程中的皱缩和张复对膜的损伤也不可忽视,这样将导致细胞受到化学和物理双重损伤。本试验对绵羊GV期和MⅡ期冷冻前后卵母细胞进行WEstERnbLottinG分析和实时荧光定量PCR检测,结果发现新鲜MⅡ期卵母细胞CD9蛋白含量和mRNA表达最高,而冷冻GV期卵母细胞中CD9蛋白含量和mRNA表达量最低。mRNA表达量降低很有可能是因为mRNA是偶极水分子、核酸及磷酸盐结构的单链分子,超低温冷冻过程中高浓度的抗冻保护剂使细胞中mRNA周围水分子大量脱出,有利于mRNA的展开,使之与RNA酶相接触而发生mRNA的水解。蛋白的降低除了上述的物理性损伤外,还与CD9mRNA降低有关。对于超低温冷冻保存对绵羊卵母细胞CD9表达量的影响,今后可作为一个指标,检测卵母细胞超低温冷冻方法和运输及冷冻解冻后的受精率是否达到标准,进而来判断处理方法的可行性。

结论:随着绵羊卵泡的形成,在绵羊初级卵泡开始就检测到CD9荧光信号,随着卵泡的生长在细胞膜和颗粒细胞上CD9荧光信号变强,且随着卵母细胞的成熟CD9蛋白含量明显增加,CD9mRNA表达量显著增加,而超低温冷冻又使之均降低。膜蛋白CD9发生异常变化,是直接或间接导致受精率、存活率甚至发育潜力下降的重要原因之一。


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