低温冷冻保存方法的研究

低温冷冻保存方法的研究

1.冷冻保存过程：鉴于牙齿的保存不同于一般的活体组织，如何保证牙体的软硬组织的活性成为冷冻保存的成功关键所在。目前冷冻保存主要有两种方法，一是快速降温冷冻，将经过抗冻处理的生物材料密封保存后，迅速投入液氮容器里，直接获得-196℃的低温.另一种是慢速降温法，是把生物材料先降温冷却至中间某一个温度后再将其直接置入液氮，这样可以使生物材料在到达冰点的时候能够维持水分的平衡，防止冰晶形成而损伤细胞。

Camps等应用2℃/min(-40℃~4℃)，5℃(-140℃~-40℃)作为降温速率保存牙齿，研究冷冻保存对牙体组织的影响，但并未对冻存后牙周膜细胞的活性进行评价。Schwart等研究成熟猴牙再植前的冷冻保存#先后采用3种降温方法进行冻存：(1)1.2℃/min(-40℃~0℃)，6℃/min(-100℃~-40℃) 投入液氮;(2)1℃/min(-60℃~0℃)，投入液氮;(3)1℃/min(-7℃~室温)，0.3℃/min(-35℃~-7℃) 投入液氮; 其结果显示第3组即缓慢冷冻组和早投入液氮组提高了正常牙周愈合的总量，并减少了所有病理参数。最近，有学者用于牙齿的冷冻保存始速率为1.5℃/min(-7℃~室温)，0.5℃/min(-40℃~-7℃) ，6℃/min(-100℃~-40℃) ，最后再迅速投入液氮降至-196℃，完成整个冷冻过程。笔者认为，细胞具有一定的耐受性，所以冷冻速率并不是一个固定的值，而是一个范围，只要不超出此范围，细胞均能存活。

2.低温保护剂的选择：冷冻保存时，需最大限度地保护组织的生理活性。因此，几乎所有种类的组织细胞，在冷冻和复温过程中均需要低温保护剂的参与。目前用于活体组织保存的低温保护剂主要分为4类：(1)低相对分子质量可渗透性保护剂，如二甲亚砜(DMSO)等;(2)低分子不可渗透物质，如蔗糖等;（3）大分子保护剂#如聚乙烯吡咯(PVP)等;(4)混合保护剂.由于单一的低温保护剂各有优缺点，不能满足生物材料冷冻保存的多方面要求，所以低温保护剂一般都是按一定配方混合使用的。在国外，牙齿冷冻保存所选择的低温保护剂主要是10%DMSO，有学者研究证明其他低温保护剂(如甘油)的抗冻效果不如 DMSO，有研究表明DMSO可以诱导细胞的成熟和分化。

3.牙齿的复温过程：牙齿的复温过程相对来说研究得较少，有学者认为，将牙齿保存容器自液氮溶液取出后，立即置于37℃的温水中浸泡3min，待冰晶融解后，将牙齿置于室温5℃，最后放入不含抗冻剂的基质中10min以完成整个复温过程。有学者则置入牛血清基质中。但是，为了保证牙周膜细胞不受损害，整个冷冻和复温过程必须在3min内完成.牙齿复温后，由于加入的低温保护剂而使牙齿的生物学功能下降的反应#称为假毒性效应，而这种假毒性效应，对生物组织来说#部分是可以耐受的和可逆的，这需要通过缓慢降低低温保护剂的浓度来实现。

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